详谈EZH2对HSCT6细胞增殖活化的影响论文
详谈EZH2对HSCT6细胞增殖活化的影响论文
肝纤维化是持续性肝脏损伤的共同病理改变过程，主要表现为细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在肝脏中的大量沉积，其持续发展可形成肝硬化和肝细胞癌。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚，研究表明肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)的增殖活化是肝纤维化形成的关键，抑制HSC的增殖活化成为防治肝纤维化的重点。有文献报道，Zeste基因增强子同源物2(enhancerofzestehomolog2，EZH2)在纤维化形成中起重要作用。肝纤维化形成过程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT通路被激活并起重要作用。研究发现，EZH2能够激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT通路，从而引起疾病。本研究拟应用EZH2的抑制剂DZNep和小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)抑制EZH2的表达，考察其对HSC增殖活化的调控作用，探究其调控机制，以期为肝纤维化的防治提供新的靶点。
1 材料
1.1 细胞株
大鼠肝星状细胞株HSC睺6购于南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 试剂与仪器
DZNep购于Selleckchem公司;TGFβ1购于Peprotech公司;噻唑蓝MTT购于Sig瞞a公司;DMSO购于Sigma公司;胰蛋白酶、DMEM培养基为Hyclone公司产品;胎牛血清购于杭州四季青公司;山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司;脂质体Lipofectami瞡eTM 2000、Opti睲EM购于Invitrogen公司;EZH2、p睧RK、ERK、p睞KT和AKT抗体购于CellSignaling公司;α睸MA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;β瞐ctin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司;倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本);酶标仪(bio瞭ekEL)。
2 方法
2.1 HSC睺6细胞的培养
应用含10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下进行细胞培养，待细胞长至70% ～80% 密度时进行细胞传代。
2.2 DZNep的应用
加入DZNep24h前，将细胞传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、应用TGFβ1刺激的模型组、TGFβ1刺激并加入DZNep的恢复组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFβ1刺激终浓度为10μg· L-1，TGFβ1作用于细胞的时间为48h;恢复组加入TGFβ1刺激终浓度为10μg· L-1，并加入DZNep刺激终浓度为1μmol· L-1，DZNep作用于细胞的时间为24h。
2.3 siRNA的合成
根据siRNA设计原则，设计针对EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表达序列标签(EST)数据库应用BLAST检索，并确认所设计siRNA序列的唯一性，靶向目的.基因EZH2的序列设计的两条链，正义链：5′睪GGCAUCUUUAU睠AAAGAUTT3′;反义链：5′睞UCUUUGAUAAAGAUGCCCTT3′。同样方法构建阴性对照组的两条链，正义链：5′睻UCUCCGAACGUGUCACGUTT3′;反义链：5′睞CGUGACACGUUCGGAGAATT3′，与任何编码序列无同源性，由吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。细胞培养及siRNA转染HSC睺6细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2 培养。转染24h前，传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、模型组、阴性对照组和EZH2瞫iRNA实验组。正常组不做任何处理;模型组加入TGFβ1;阴性对照组转染FAM标记的阴性对照siR睳A并加入TGFβ1;实验组转染EZH2瞫iRNA并加入TGFβ1。用Opti睲EM和脂质体作为转染试剂进行转染，使siRNA终浓度均为100pmol· L-1，置于37℃、5% CO2培养箱转染6h后，每组加入完全培养基含TGFβ1使刺激终浓度为10μg· L-1，继续培养48h，收获细胞。采用荧光倒置显微镜观察各组转染后的细胞形态并判断转染效果。
2.4 细胞增殖实验
以MTT法检测HSC睺6细胞的增殖，分组同上。将培养的HSC睺6细胞以10%胎牛血清的DMEM制备成1×108· L-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL，过夜，待细胞贴壁后进行细胞转染，转染后6h换液，每孔加入完全培养基200μL含TGFβ1使刺激终浓度为10μg·L-1，37℃、5% CO2培养箱中继续培养12、24、48、72h，然后每孔加05% MTT贮存液20μL继续孵育4h，最后弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜溶解细胞内结晶，置于恒温震荡器上震摇10min，应用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值，以空白对照组作为对照组，其细胞存活率为100%，其余各组按：存活率/% =[(各实验组吸光度值脖镜孜光度值)/(对照组吸光度值-本底吸光度值)]×100%。
2.5 Westernblot检测EZH2、p睧RK、p睞KT、α睸MA蛋白表达
细胞的培养、分组、处理同上。DZNep作用24h或者转染EZH2瞫iRNA48h后，分别提取细胞总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。应用10% SDS睵AGE凝胶进行电泳，在200mA恒定电流下应用PVDF膜进行转膜，TBST洗膜后，使用5% 牛奶封闭非特异性结合位点，TBST洗膜后，在4℃于一抗(1∶500)中孵育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗(1∶10000)室温中孵育1h，TBST洗膜后，加入ECL发光剂反应20s，电脑显影成像，实验重复3次或以上。
2.6 统计学处理
采用SPSS130软件进行统计分析，数据以珋x±s表示。两组间比较采用t检验，多__组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 Westernblot法检测应用DZNep后HSC睺6细胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表达变化 加入TGFβ1的模型组EZH2蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<001)，加入TGFβ1和DZNep的恢复组EZH2蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<001)，见Fig1A;同时，模型组p睧RK和p睞KT蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<001)，恢复组p睧RK和p睞KT蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<001)，见Fig1B;与此同时，模型组α睸MA蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性(P<001)，恢复组α睸MA蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性(P<001)，见Fig1C。
3.2 MTT法检测HSC睺6增殖活性 MTT实验结果显示，EZH2瞫iRNA瞬时转染对TGFβ1诱导的HSC睺6细胞的增殖有明显的抑制作用，EZH2瞫iR睳A实验组作用12h细胞抑制率与阴性对照组、模型组之间差异无显著性(P>005);EZH2瞫iRNA实验组作用24、48、72h细胞抑制率明显高于阴性对照组、模型组(P<005)。同时，作用24、48、72h时模型组、阴性对照组与正常组之间差异有显著性(P<005)，见Fig2。
3.3 Westernblot法检测siRNA转染后HSC睺6细胞中EZH2、p睧RK、p睞KT和α睸MA蛋白表达变化 瞬时转染EZH2瞫iRNA48h后，EZH2蛋白表达明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<001)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001)，见Fig3A;同时，EZH2瞫iRNA实验组p睧RK和p睞KT蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<001)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001)，见Fig3B;与此同时，EZH2瞫iRNA实验组α睸MA蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性(P<001)，阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性(P<001)，见Fig3C。
4 讨论
HSC的增殖活化是肝纤维化发生发展的关键环节，抑制HSC的增殖活化成为预防和治疗肝纤维化的重要手段之一。近些年研究发现，表观遗传学(包括DNA甲基化、microRNA和组蛋白修饰等)在肝纤维化的发生发展中扮演重要角色。组蛋白修饰是指在组蛋白相关酶的作用下，组蛋白发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等修饰的过程。组蛋白的甲基化修饰是由组蛋白甲基转移酶来实现的，组蛋白的甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，最终可导致基因的转录沉默或转录激活。研究发现，组蛋白的甲基化修饰与HSC的状态及转归密切相关。EZH2是一个重要的组蛋白甲基转移酶，通过特异性甲基化基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27，广泛参与了基因的转录沉默。在癌症的发生发展中，EZH2被认为是一个促癌基因，在子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中高表达。有研究发现，EZH2在肝纤维化形成中扮演重要角色，但是其具体机制尚不清楚。
有文献报道，在生长因子TGFβ1等的刺激下，MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路被激活，进而影响到大鼠肝星状细胞HSC睺6的增殖活化。有研究发现，EZH2能够激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路从而引起疾病的发生。那么EZH2能否影响TGFβ1诱导的HSC的增殖活化，EZH2通过何种机制影响其增殖活化，目前尚未见文献报道。在该项研究中，应用TGFβ1诱导HSC增殖活化，同时应用EZH2的抑制剂DZNep和siRNA技术，抑制HSC睺6中EZH2的表达，观察EZH2表达下调后对TGFβ1诱导的HSC增殖活化的影响，及其对MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的影响。应用EZH2的小干扰RNA后，与阴性对照组比较，EZH2瞫iRNA实验组EZH2蛋白表达水平明显降低，表明瞬时转染实验成功。MTT法是评估细胞增殖的一种有效方法，MTT的结果表明，通过siRNA沉默EZH2的表达可明显抑制TGFβ1诱导的HSC睺6细胞的增殖。α睸MA是HSC活化的特征性标志，Westernblot检测结果显示，应用抑制剂DZNep后，可明显降低α睸MA蛋白的表达;靶向干扰HSC睺6细胞中EZH2的表达，可明显降低α睸MA蛋白的表达。表明抑制EZH2的表达能影响TGFβ1诱导的HSC的增殖活化。结果进一步表明，应用TGFβ1刺激HSC睺6细胞可明显升高EZH2蛋白表达水平，也可明显升高p睧RK、p睞KT蛋白表达水平。应用抑制剂DZNep后可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可明显降低p睧RK和p睞KT蛋白表达水平。靶向干扰HSC睺6细胞中EZH2基因的表达，可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可降低p睧RK和p睞KT蛋白表达水平。表明抑制EZH2的表达能影响TGFβ1诱导的HSC中MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活。抑制EZH2的表达能影响MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的激活，是影响TGFβ1诱导的HSC增殖活化的机制。
综上，抑制HSC睺6细胞中EZH2基因的表达，能影响TGFβ1诱导的HSC 中MAPK/ERK 和PI3K/AKT信号通路的激活，从而抑制HSC的增殖活化。本研究从细胞分子水平阐明EZH2对HSC的增殖活化的调控作用及其可能的潜在调控机制。揭示了EZH2在肝纤维化发展中的重要作用，可能成为防治肝纤维化的潜在新靶点，还需要通过其它实验进一步验证。肝纤维化的形成过程非常复杂，EZH2如何调控基因的沉默，尚需进一步深入研究。