谈乳果糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白4表达的影响的论文
谈乳果糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白4表达的影响的论文
便秘是消化道常见的慢性病症,随着饮食结构变化及精神、心理因素的影响,其发病呈上升趋势,严重影响着人类的身心健康,水代谢紊乱为其主要的发病环节。水通道蛋白(aquaporins,AQP)是特异性转运水的蛋白家族,参与机体水的分泌、吸收及细胞内外水平衡的调节,已有研究发现水通道蛋白3、4、8 等存在于结肠,与结肠水吸收密切相关。渗透性泻药,通过提高肠腔内渗透压,使粪便含水量增加,缓解便秘症状,但其具体作用机制及和水通道蛋白之间的联系尚不明确,本研究通过构建小鼠便秘模型,应用免疫组化和反转录-聚合酶连反应(RT-PCR)方法研究乳果糖对便秘小鼠结肠AQP4 表达情况的影响,探讨乳果糖和AQP4 之间的关系,为临床便秘治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组:健康昆明雄性小鼠30 只,体质量(20.0±2.0)g,随机分为阴性对照组、便秘模型组、乳果糖治疗组。
1.2 便秘模型制备、成功标准、取材:
①模型制备:参照文献,便秘组给予50 mg/kg 的复方地芬诺酯灌胃,阴性对照组给予等量的蒸馏水灌胃。灌胃后动物均单笼饲养,正常饮食进水。便秘模型造模成功后,将模型随机分为乳果糖治疗组和便秘模型组,治疗组给予乳果糖(0.6 ml/20 g)灌胃,模型对照组和阴性对照组给予等量的蒸馏水灌胃。
② 模型判定标准:观察阴性对照组与便秘模型组小鼠首粒排便时间、12 h内排便粒数和排便重量数值比值,差异有统计学意义(P<0.05),便秘模型制备成功。
③取材:实验小鼠以水合氯醛腹腔麻醉并处死,迅速取升、降结肠组织各1 块,置于-85 ℃冰箱,供RT-PCR 使用。
1.3 RT-PCR 测定结肠AQP4mRNA 表达:
选用β-肌动蛋白基因为内参照引物基因,反应中所用的上游引物为:5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGCC-3′,下游引物为5′-CAGGTCCAGACGACGCAGGATGGC-3′,扩增产物为:270 bp;AQP4(Genbankaccession number U14007)上游引物为:5′-GGGTTGGACCAATCATAGGCGCT-3′(701-723),下游引物为:5′-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3 (1030-1005),扩增产物为:330 bp。cDNA 序列查自基因库,2 对引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应步骤及反应体系见MBIFermentas 公司试剂盒说明,AQP4 反应条件为94 ℃ 30 s,62℃ 30 s,72 ℃30 s,共36 个循环;β-肌动蛋白反应条件为94℃ 20 s,58 ℃ 30 s。72 ℃ 30 s,共35 个循环。琼脂糖凝胶电泳及半定量分析:取PCR 扩增产物5 μl,置1%琼脂糖凝胶中,TBE 电泳缓冲液中4 V/cm 电压电泳60 min,用GDS7500图像分析系统(英国UVP 公司)进行密度扫描定量,以AQP4基因与β-肌动蛋白比值表示AQP4 mRNA 的相对表达量。
1.4 统计学处理:
计量资料以x±s 表示,所有数据均用SPSS17.0 软件分析。AQP4 表达量的比较采用析因设计的方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠便秘模型及药物干预结果:
20 只便秘模型(包括乳果糖治疗组用药前)小鼠与阴性对照组比较,首粒排便时间明显延长,12 h 内排便粒数、排便质量明显减少(P<0.01),便秘模型制备成功。乳果糖治疗组(用药后)与阴性对照组以上指标差异无统计学意义(p>0.05),与便秘模型组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.01),说明用药后便秘症状改善,药物治疗有效。